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生命科學(xué)
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快速蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒和測(cè)定稀釋劑，提供方便的解決方案，有助于開發(fā)您自己的測(cè)定。
簡(jiǎn)介: 與生物治療分子相連的聚乙二醇聚合物可以提高這些大分子量藥物的體內(nèi)釋放和穩(wěn)定性。然而，這些聚合物本身可能具有免疫原性，并且可以誘發(fā)抗體，從而降低藥物的功效，導(dǎo)致潛在的病人發(fā)病率。建立了一種雙抗原橋接 elisa 免疫原性檢測(cè)方法，用于檢測(cè)不同尺寸聚乙二醇聚合物特異性的抗藥性抗體。方法: 合成40kda 聚乙二醇半抗原標(biāo)記偶聯(lián)物，用于雙抗原橋接 elisa 檢測(cè)。半抗原標(biāo)記的栓子與患者樣本孵育，然后將這種混合物加入預(yù)涂有40kda 栓子的96孔微孔板中，使栓子特異性 ada 與栓子共軛物和栓子涂在微孔板上形成橋接復(fù)合物。孵育后，去除反應(yīng)混合物，代之以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗半抗原抗體。充分培養(yǎng)后，洗凈平板，加入底物試劑。酶的顏色發(fā)展與 ada 成正比，在2n 硫酸作用下20min 后停止，每個(gè)吸光度在450/630nm 處測(cè)量。對(duì)350份正常人血清進(jìn)行了劑量反應(yīng)、耐藥性、基質(zhì)效應(yīng)、重復(fù)性、特異性/非特異性藥物耗竭試驗(yàn)和篩選切點(diǎn)測(cè)定。結(jié)果: 以抗釘鼠單克隆 igm 為陽(yáng)性對(duì)照，建立了釘鼠免疫原性 elisa 的重復(fù)性劑量反應(yīng)曲線。在總共350名天真捐贈(zèng)者中的15份人血清樣本中發(fā)現(xiàn)了已存在的 peg 特異性抗體，這些抗體被證明對(duì) peg 聚合物結(jié)構(gòu)具有高度特異性。該方法沒(méi)有顯著的基質(zhì)效應(yīng)，重復(fù)性很好。討論: 一個(gè)雙抗原橋接免疫原性試驗(yàn)檢測(cè)抗體釘在典型的聚合物 siz
1. 介導(dǎo)免疫原性試驗(yàn)檢測(cè)循環(huán)抗藥性抗體(adas)已成為生物治療學(xué)研究的重要手段，因?yàn)檫@些高分子重量藥物可引起潛在的有害免疫反應(yīng)，影響藥物的療效和安全性。在許多策略中，這種大分子的潛在免疫原性可以通過(guò)附加聚乙二醇(peg)聚合物來(lái)減少。聚乙二醇與藥物或治療蛋白的共價(jià)連接可以保護(hù)生物治療免受宿主免疫系統(tǒng)的影響，通過(guò)掩蓋其免疫原性表位來(lái)降低其免疫原性，同時(shí)通過(guò)增加藥物的流體動(dòng)力學(xué)大小來(lái)延長(zhǎng)藥物的循環(huán)半壽命，從而減少腎間隙。Peg 由于其結(jié)構(gòu)和低電荷密度，一直被認(rèn)為是不具有免疫原性的，但直到最近，這種觀點(diǎn)大多是軼事性的。基于單獨(dú)的大小，聚乙二醇聚合物在分子大小范圍內(nèi)通常用于藥物設(shè)計(jì)(10至40千達(dá))是潛在的免疫原性。Richter 和 akerblom (1983,1984)在用聚乙二醇化蛋白免疫的動(dòng)物中成功地產(chǎn)生了抗聚乙二醇抗體，1984年，在第一種聚乙二醇化藥物獲得批準(zhǔn)之前，已經(jīng)報(bào)道在人體中存在抗聚乙二醇抗體。他們計(jì)算出0.2% 的健康人群有抗 peg 抗體，這些抗體大部分是 igg。他們還得出結(jié)論，為了用聚乙二醇化過(guò)敏原進(jìn)行減敏治療，這些抗體并不構(gòu)成重大問(wèn)題。根據(jù)后來(lái) leger 等人(2001年)、 armstrong 等人(2003年)和 garratty 等人(2004年)的研究，抗 peg 抗體在健康人群中的發(fā)生率要高得多(22-25%)。此外，誘導(dǎo) peg 免疫并不像最初認(rèn)為的那樣無(wú)害。 gansonet al. (2006)報(bào)告說(shuō)，與未免疫的患者相比，用聚乙二醇化酶治療難治性 goutsulted 的患者產(chǎn)生 peg 特異性抗體的清除率更高。Armstrong 等人(2007年)報(bào)告了在 peg-immune 淋巴細(xì)胞白血病患者接受 peg 化天冬酰胺治療時(shí)快速清除藥物的相似結(jié)果。這兩個(gè)例子中的抗 peg 抗體的存在都會(huì)增強(qiáng)給藥藥物的有效性。事實(shí)上，幾個(gè)動(dòng)物的 igm 和 igg 抗體現(xiàn)在已經(jīng)成功地開發(fā)針對(duì) peg 聚合物的進(jìn)一步證明了這些結(jié)構(gòu)的免疫原性[ cheng et al. (2000) ，cheng et al. (2005)]。因此，檢測(cè)與生物治療分子相關(guān)的 adas 是藥物安全研究的必要組成部分，需要一種普遍適用于所有聚乙二醇化蛋白質(zhì)藥物的標(biāo)準(zhǔn)方法。雙抗原橋接免疫原性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)已成功地應(yīng)用于該領(lǐng)域。該方法可以檢測(cè)到不同長(zhǎng)度的聚乙二醇聚合物抗體，并附有不同的官能團(tuán)，是檢測(cè)任何聚乙二醇生物治療產(chǎn)生的聚乙二醇特異性抗藥性抗體的一種有潛力的通用方法。圖2。材料和方法。采用 anp 技術(shù)制備了ー40kda 聚乙二醇偶聯(lián)物，制備了抗 peg 鼠單克隆 igm (anpeg-1)抗體，并以40kda 聚乙二醇作為免疫原制備了 anp 擁有屬性。校準(zhǔn)品是在一個(gè)天真的人血清庫(kù)中，通過(guò)連續(xù)稀釋這種抗體制備的。用 anptechnologies 公司的 peg (40kda)涂層96孔微孔板制備了化驗(yàn)稀釋液(pbs 緩沖液加 hama 阻斷劑)和化驗(yàn)洗滌緩沖液(pbs 加洗滌劑) ，并用 anp 技術(shù)制備了共軛小鼠抗半抗原抗體，用 anp 技術(shù)從 moss 公司的停止液(硫酸，2.0 n)中購(gòu)買了化驗(yàn)稀釋液(tmb) ，從 vwr 公司2.2中獲得了化驗(yàn)稀釋液(2.0 n)。Elisa 方法的優(yōu)化 elisa 方法的優(yōu)化是通過(guò)測(cè)試兩種可能的捕獲配置，40kda 聚乙二醇直接涂在平板上或生物素標(biāo)記版涂在鏈霉親和素活化平板上。采用生物素化聚乙二醇修飾的鏈霉菌素平板進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，采用生物素化聚乙二醇修飾的鏈霉菌素平板具有較好的信號(hào)動(dòng)力學(xué)范圍。將構(gòu)成橋配合物另一半的半抗原標(biāo)記藥物與樣品混合，加入生物素聚乙二醇固定的微孔中，然后與 hrp 標(biāo)記的抗單克隆抗體反應(yīng)。優(yōu)化了兩種標(biāo)記物的濃度和檢測(cè)孵育時(shí)間，以獲得優(yōu)良靈敏度和信號(hào)動(dòng)態(tài)范圍。用半抗原標(biāo)記和生物素化藥物預(yù)孵化血清樣品，然后加入包被良好的二價(jià)鏈霉親和素或小鼠抗半抗原抗體的檢測(cè)方法，靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍均不理想。將生物素化聚乙二醇預(yù)涂于鏈霉菌抗生素涂層平板上，獲得了優(yōu)良的靈敏度和信號(hào)范圍。
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