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epicypher
產(chǎn)品時間：2020-04-11
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EpiDyne®染色質(zhì)重塑酶
ATP依賴的染色質(zhì)重塑酶是癌癥中常見的突變蛋白之一，使其成為開發(fā)新型治療策略的要目標(biāo)。EpiDyne®平臺利用EpiCypher dNucs作為底物來研究核小體重塑。為了補充這些測定，EpiCypher提供了一系列重塑酶，包括SMARCA2和SMARCA4（SWI / SNF復(fù)合體的ATPase）和ACF ISWI型復(fù)合體。epicypher一級代理
EpiDyne：下一代表觀遺傳學(xué)測定的工具
EpiDyne染色質(zhì)重塑酶可用于多種測定讀數(shù)，包括：
FRET （在此處閱讀技術(shù)說明） –兼容HTS
輻射DAM甲基轉(zhuǎn)移酶測定–與HTS兼容
限制酶的可及性（在此處閱讀技術(shù)說明）
可及性*定義的核小體底層工程，用于染色質(zhì)重塑研究
概述核小體重構(gòu)(或重定位)調(diào)節(jié)染色質(zhì)上的 dna 通路，從而影響基因表達和基因組修復(fù)。 許多 atp 依賴的重塑酶(及其多亞基復(fù)合物)與人類疾病相關(guān)，但由于對核小體基底物的需求，它們是*的具有挑戰(zhàn)性的生物化學(xué)研究目標(biāo)。 上胚層通過開發(fā) epidyne 解決了這個問題，epidyne 是一系列重組核小體底物，可以在體外監(jiān)測核小體重構(gòu)活性。 在這里，我們描述了硬膜外核小體重構(gòu)底物在限制酶可及性(rea)測定中的應(yīng)用
染色質(zhì)重塑作為治療目標(biāo)核小體組織，可以嚴(yán)重擾亂基因表達、 dna 修復(fù)和細胞分化，在許多人類疾病(如癌癥、炎癥、自身免疫、精神分裂癥、心血管疾病和智能障礙)中發(fā)揮重要作用。 值得注意的是，近20% 的癌癥含有來自依賴 atp 的 swi / snf 家族染色質(zhì)重塑復(fù)合體亞基的突變。 這些酶復(fù)合體通過將 dna“泵”到組織八聚體周圍來調(diào)節(jié)局部基因組訪問，從而沿著 dna 重新定位核小體[1]。 在多種癌癥中觀察到 swi / snf 亞基的反復(fù)突變，這支持了腫瘤發(fā)生中的驅(qū)動因子作用[2]。 突變復(fù)合物是理想的治療目標(biāo)，因為進一步損害它們的 atp 酶活性會促進癌細胞死亡，但不會損害正常細胞[2,3]。 這種現(xiàn)象被稱為人工合成殺傷性，利用它來識別抑制劑可能導(dǎo)致具有癌癥特異性的藥物[4,5]。 核小體重構(gòu)實驗利用重組單核小體亞層發(fā)展了 epidyne 家族的核小體重構(gòu)底物來研究染色質(zhì)再模擬酶的活性。核小體，147個堿基對的 dna 纏繞在核心組蛋白質(zhì)周圍，代表了染色質(zhì)的基本重復(fù)單位。 硬膜外核糖核酸體是由一個重組的人組蛋白八聚體包裹在一個含有末端核小體定位序列(147個堿基對)的 dna 中，與一個70個堿基對的下游受體區(qū)相鄰。這個位置的組蛋白八聚體保護了一個限制酶識別位點(例如 dpnii [ gatc ]或 mfe1[ caattg ]) ，這個位點是通過一個相關(guān)的核小體重塑以允許 dna 切割而暴露出來的(圖1)。
這種第yi代 epidyne 底物還兼容高通量讀數(shù)，例如與 gatc 特異性的 dammethyltransferase [6,7]進行放射標(biāo)記。 我們目前正在開發(fā)與其他高溫超導(dǎo)平臺兼容的下一代重塑基板，包括熒光偏振和熒光分析。
圖1: epidyne 核小體重塑亞層 epidesyne 核小體重塑底物包裹著一個強大的核小體定位序列(widom601) ，以屏蔽一個目標(biāo)基序(綠盒子)。 目標(biāo)基序要么是限制酶識別位點，要么是該死的甲基化序列。 橙色 dnasequence 代表基于70對的受體區(qū)域。 在依賴 atp 的重塑器(例如酵母菌 rsc，或人類 swi / snf atpase，例如 smarca2 / 4)作用后，目標(biāo)部位暴露出來，然后可以用限制酶切割或用水壩甲基化。 后者可以立即兼容 hts 應(yīng)用程序。
實驗所需的試劑和材料: 貯存蛋白質(zhì) aliquots@- 80 c，避免凍結(jié) / 解凍酵母 rsc 重構(gòu)復(fù)合物[9](底物也與人類 smarca2 / 4 / brm / brg1復(fù)合物相容; 未顯示)•硬膜內(nèi)重構(gòu)底物(epicypher catalog catalog no。16-4101)•陽性對照裸 dna 模板 gatc1(epicypher catalogno。 18-4101)•負面控制裸 dna 模板 gatc0(epicypher catalogno。 18-4100)•限制酶(對于 gatc 的乳溝，使用 dpnii (neb 目錄編號 r0543t) ; 對于 cag 的乳溝，使用 mfei (neb 目錄編號:。 分析緩沖液(20mm tris ph7.5,50mm kcl，3mm mgcl2和0.1 mg / mlbsa (sigma catalog no。 A3059)分析淬火緩沖液(新鮮: 10mm tris ph7.5,40mm edta，0.6% sds 和50g / ml 蛋白酶 k (worthington bio-chem。 公司，目錄號碼。 Proks). •8% 天然聚丙烯酰胺凝膠(37.5:1)在1xtbe-溴化乙錠(etbr，10mg / ml)中組裝 / 分解• etbr 染色 dna 標(biāo)準(zhǔn)曲線成像裝置1。 添加硬膜外基質(zhì)，或者控制 dna (陽性或陰性)到0.5 ml 埃本多夫試管(建議三個試管并行運行)。 無痛分泌物的濃度會隨你特定的 atp 酶而變化。 對于 rsc，使用20nm 核小體. 2。 在預(yù)定體積中加入測定緩沖液(典型反應(yīng)為20l，相當(dāng)于 ~ 100ng dna)3。 加入染色質(zhì)重塑(例如 rsc，10nm)4。 加入50個所需限制酶(例如 dpnii)5。 通過加入2毫米 atp6引發(fā)反應(yīng)。 在23-37攝氏度(rsc 為30攝氏度)孵化反應(yīng)，以獲得所需的時間點7。 通過添加等量的分析淬火緩沖劑來淬火反應(yīng)，然后在50 °c 下培養(yǎng)20分鐘。 非變性丙烯酰胺凝膠樣品。 用 etbr (0.2 g / ml)在1xtbe 中染色10分鐘。 在1xtbe 中注入凝膠，在合適的成像設(shè)備上進行可視化
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